آزمایشگاه دکتر حیدری

تشخیص غیرتهاجمی پیش از تولد از رویا تا واقعیت

موقعی که من دانشجوی پزشکی در آکسفورد بودم به موضوع تشخیص پیش از تولد علاقه‌مند شدم. پیشرفت‌هایی که در زمینه تشخیص پیش از تولد هموگلوبینوپاتی‌ها با پرچمداری پروفسور Yuet wai kan از دانشگاه کالیفرنیا و پروفسور David Weatherall از دانشگاه آکسفورد انجام شده بود مرا تحت‌تأثیر قرار داد. همچنین من این خوشوقتی را داشتم که خارج از برنامه درسی، تجربیات دست اولی را در تحقیقات آزمایشگاهی زیر نظر دکتر Kenneth Fleming (شکل 1) داشته باشم. یک روز سخنرانی پروفسور John Bell را شنیدم که در خصوص یک روش جدید بنام PCR صحبت می‌کرد؛ این موضوع شدیداً توجه مرا جلب نمود. بعد از اتمام سخنرانی موفق شدم که وی را متقاعد نمایم که این روش را به من آموزش دهد. به‌زودی توانستم کارآیی و نیز کاستی‌های بالقوه (مانند حساس بودن به آلودگی) این روش قدرتمند را درک کنم، سپس در زمینه روش‌های جدید تشخیص پیش از تولد علاقه‌مند شدم. یکی از اشکالات روش‌های تشخیص پیش از تولد که مبتنی بر DNA بودند نیاز به نمونه‌گیری تهاجمی از بافت جنین بود که به‌عنوان مثال توسط آمنیوسنتز انجام می‌شد. این‌گونه نمونه‌گیری یک خطر کوچک اما قطعی برای جنین داشت. برای اجتناب از چنین خطری دانشمندان زیادی سال‌ها در خصوص انجام تشخیص پیش از تولد غیرتهاجمی ایده‌پردازی کردند. در راستای نیل به این هدف از اواخر دهه 1960 تلاش‌هایی بعمل آمد تا سلول‌های هسته‌دار جنین را از خون مادر جدا کنند، اما این تلاش‌های اولیه مبتنی بر سیتوژنیک متداول یا روش‌های رنگ‌آمیزی (مثل رنگ‌آمیزی (quinacrine) برای سلول‌های مرد) بود. و من فکر کردم شاید بتوان حساسیت PCR را جهت تشخیص سلول‌های جنسی در خون مادر بکار گرفت. سپس فرض کردم که برای به حداکثر رساندن شانس موفقیت شاید بتوان دو سری PCR را به‌طور متوالی انجام داد. من این روش را سیستم تقویت دوگانه نامیدم که امروزه بنام nested PCR نامیده می‌شود و با استفاده از این سیستم توانستم DNA جنین را در خون مادر آشکار کنم. سایر محققین نیز اندکی بعد تشخیص سلول‌های جنین را در خون مادر توسط PCR و روش‌های سیتوژنیک مولکولی به همراه روش‌های مختلف غنی‌سازی سلول‌های جنینی گزارش نمودند. معذلک تمام این تلاش‌ها از جمله تلاش‌های خود من توسط موارد مثبت و منفی کاذب مختل می‌شد. دلیل اصلی این مشکل تعداد بسیار کم سلول‌های جنین در خون مادر است. دلیل دیگر استمرار بقای سلول‌های جنینی در خون مادر از یک حاملگی تا حاملگی بعدی است. در حقیقت من 8 سال را در این زمینه کار کردم بی‌آنکه موفقیت چشمگیری بدست آورم. در سال 2002 مشخص شد که کمبود سلول‌های جنینی در خون مادر مانع ایجاد روش‌های عملی و قوی برای تشخیص پیش از تولد محسوب می‌گردد، بنابراین علاقه به فعالیت در این حیطه از بین رفت.

سال 1997 سال بسیار ویژه‌ای برای هنگ‌کنگ یعنی شهر تولد من بود. در این سال باید این شهر که از سال 1841 مستعمره بریتانیا بود به تملک چین بازگردد. گرچه بسیاری از افراد بخاطر ترس از آینده نامطمئن قبل از سال 1997 هنگ‌کنگ را ترک کردند، اما برای من و همسرم فرصتی بود تا به مام میهن بازگردیم. می‌دانستم که پس از بازگشت به هنگ‌کنگ باید شغل جدیدی بدست آورم و فکر کردم که اکنون فرصت خوبی است تا یک شغل جدید و بالقوه پرریسک را آزمایش کنم. در سپتامبر 1996، درست 4 ماه قبل از آنکه من به هنگ‌کنگ بازگردم دو مقاله در مجله Nature چاپ شد که در خصوص وجود DNA تومورال در جزء بدون سلول خون در بیماران سرطانی بود. من فکر کردم که توده سرطانی که در بدن یک فرد رشد می‌کند بی‌شباهت به رشد جنین در رحم مادر نیست لذا فرض کردم که باید بتوان DNA جنین را در پلاسما یا سرم مادر شناسایی کرد. با همکاری پروفسور James Wainscoat که یک هماتولوژیست در آکسفورد است ما توانستیم حضور DNA جنین را در پلاسما و سرم مادر نشان دهیم. در بیشتر مواقعی که جنین پسر بود ما توانستیم کروموزوم Y جنین را با استفاده از فقط lµ10 پلاسما یا سرم جوشانده شده مادر نشان دهیم و این تجربه بیانگر میزان بالای حضور DNA خارج سلولی جنین در سرم مادر است.

از آنجا که مشتاق بودم بدانم در چه غلظت‌هایی می‌توان DNA جنین را در خون مادر شناسایی کرد به بررسی روش‌های سنجش کمی DNA پرداختم. در اواخر 1996 روشی به نام real-time PCR معرفی شد که در این روش روند تکثیر DNA پایش می‌شد و لذا روش دقیقی برای سنجش غلظت DNA اولیه محسوب می‌گردید، اما برای انجام چنین آزمایشی نیاز به دستگاه‌های گران‌قیمت همچون ترمال سایکلر و دوربین فلورسانس بود. در روز بعد از کریسمس 1996 من به خانه رئیس آینده‌ام دعوت شدم. تصمیم گرفتم تا از وی خواهش کنم یک دستگاه RT-PCR برای آزمایشگاهم در هنگ‌کنگ تهیه کند که در کمال تعجب خیلی فوری با این درخواست موافقت کرد و من بزرگ‌ترین هدیه کریسمس تمام عمرم را دریافت کردم.

در ژانویه 1997 کارم را در هنگ‌کنگ آغاز کردم و شروع کار با پروژه اندازه‌گیری غلظت DNA جنین در پلاسما و سرم مادر بود. نسبت غلظت DNAجنین در پلاسمای مادر بطور قابل‌توجهی بالا بود بطوری که در ابتدای حاملگی 3% و در اواخر حاملگی به 6% می‌رسید. در مقایسه با سلول‌های هسته‌دار جنین در خون مادر این مقدار خیلی زیاد بود. مقدار سلول‌های هسته‌دار جنین در خون مادر 1 سلول به ازای 10⁵ یا 10⁶ سلول خون مادر است. اندازه‌گیری متوالی در گروهی از زنان حامله نشان داد که DNA جنین از هفته هفتم حاملگی در سرم مادر ظاهر می‌شود. در مجموع این داده‌ها نشان می‌داد که سنجش DNA جنین در سرم مادر یک روش ارزشمند در تشخیص پیش از تولد می‌تواند باشد. غلظت بالای این ماده نشان می‌داد که در مقایسه با سلول‌های هسته‌دار جنین در خون مادر، می‌تواند بسیار کارآمدتر باشد. علاوه بر این غلظت DNA جنین در خون مادر در زمان‌های مختلف حاملگی می‌تواند پایه‌ای برای طراحی بنیاد تشخیص بر مبنای این ماده باشد.

همانطور که قبلاً اشاره شد استمرار وجود سلول‌های جنین در خون مادر از یک حاملگی به حاملگی بعدی بر سر راه تشخیص پیش از تولد با استفاده از این سلول‌ها ایجاد مشکل می‌کرد. من خواستم بدانم آیا این مشکل در استفاده از DNAی جنین نیز وجود خواهد داشت یا نه؟ بنابراین تعدادی از زنان را که به‌ روش سزارین زایمان کرده بودند مورد آزمایش قرار دادم و متوجه شدم که DNAی جنین خیلی سریع پس از زایمان از خون مادر محو می‌شود. درواقع نیمه‌عمر DNA جنین در خون مادر حدود 16 دقیقه است.

این اطلاعات تأئید می‌کردند که استفاده از DNAی جنین در تشخیص پیش از تولد مشکل استفاده از سلول‌های جنین را نخواهد داشت و حضور آن از یک حاملگی به حاملگی بعدی استمرار نخواهد یافت.

بنابراین با اتکا به سه مطالعه پیش‌گفت که اساس پارامترهای بیولوژیک این پدیده را تشکیل می‌دهند تصمیم گرفتم تا از DNA جنین به‌عنوان تشخیص غیرتهاجمی قبل از تولد در مورد وضعیت Rh جنین‌هایی استفاده کنم که مادر Rh-D منفی است. این مطالعه از این جهت مهم است کــه اگر جنین Rh-D مثبت باشد، ممکن است در مادر ایجاد واکنش ایمنی علیه آنتی‌ژن Rh-D نماید که آنتی‌بادی ایجادشده می‌تواند در حاملگی‌های بعدی در صورتی که جنین Rh-D مثبت باشد، به جنین آسیب بزند. بنابراین مفید است بدانیم که کدامیک از مادران Rh-D منفی در خطر هستند و کدام در خطر نیستند. من موفق شدم که Rh-Dی جنین را در خون مادر با استفاده از DNAی جنین و روش RT-PCR با دقت بالا تعیین کنم. این آزمایش از سال 2001 در اروپا و چند سال بعد در امریکا رایج شد و درواقع اولین کاربرد بالینی تشخیص پیش از تولد با استفاده از DNA است.

سندرم داون بعلت افزایش مواد ژنتیکی در روی کروموزوم 21 بوجود می‌آید که در بیشتر موارد یک نسخه اضافه از کروموزوم وجود دارد، بنابراین ایجاد روشی که بتواند بطور دقیق این مواد اضافه را اندازه بگیرد می‌تواند روش تشخیص پیش از تولد سندرم داون باشد. DNAی جنین جزء کوچکی از کل DNA است که در سرم مادر یافت می‌شود، بنابراین در سندرم داون این جزء افزایش می‌یابد و تمرکز بر اندازه‌گیری آن می‌تواند نقش تشخیص پیش از تولد را پررنگ‌تر کند. بافت‌های مختلف تغییرات خاص خود را بر روی DNA اعمال می‌کنند و براساس این تغییرات باید بتوان DNAی جنین را از مادر تمایز داد. به این تغییرات عموماً تغییرات اپی‌ژنیک گفته می‌شود. بیشترین تغییر اپی‌ژنیک که مورد مطالعه قرار گرفته است متیلاسیون DNA است.

در سال 2002 من روشی را توصیف کردم که بر اساس متیلاسیون DNA بود و آن را در شناسایی DNAی جنین در پلاسمای مادر بکار گرفتم. تجربیات بعدی نشان داد که از این روش می‌توان در تشخیص پیش از تولد سندرم داون و سندرم ادواردز استفاده کرد.

در همان زمان به‌موازات کار کردن بر روی متیلاسیون DNA بر روی روش دیگری هم کار می‌کردم؛ فرض من این بود که در میان سلول‌های بافت‌های مختلف، ژن‌های مختلفی به حالت فعال (switched on) وجود دارند، بنابراین ژن‌هایی که در بافت جنین، فعال و در بافت مادر غیرفعال هستند امکان دیگری برای شناسایی DNAی جنین در پلاسمای مادر فراهم می‌کنند.

در سال 2000 گروه دیگری از محصولات ژنی موسوم به mRNAی جنین را در پلاسمای مادر کشف کردم. کشف mRNA در پلاسمای مادر تا حد زیادی تعجب‌برانگیز بود چرا که در آن زمان باور عمومی این بود که mRNA یک مولکول شکننده است و نمی‌تواند در پلاسما که حاوی نوکلئازهای مختلف است دوام بیاورد. تحقیقات بعدی نشان داد که این mRNAها توسط ذراتی محافظت می‌شوند. بر اساس تحقیقات بعدی مشخص شد که از آزمایش mRNA پلاسما می‌توان برای تشخیص پیش از تولد سندرم داون استفاده کرد.

گرچه روش‌های مبتنی بر متیلاسیون DNA و بررسی mRNA در تشخیص اختلالات کروموزومی جنین به نظر عملی و شدنی می‌آمد، اما مارکرهای خوب مبتنی بر این روش‌ها مستلزم بهینه‌سازی قابل‌توجه و در بسیاری موارد بررسی همزمان مارکرهای تغییرات DNA (نظیر پلی‌مورفیسم‌های منفرد نوکلئوتید) می‌باشد که انجام آن برای تمامی موارد حاملگی ممکن نیست، لذا تصمیم گرفتم به دنبال روشی باشم که این محدودیت‌ها را نداشته باشد. یک راه، ایجاد روش‌های بسیار دقیق برای اندازه‌گیری است که اجازه می‌دهد تا تغییر مقدار کروموزوم جنینی (مثل افزایش کروموزوم سندرم داون) حتی در صورتی که توسط DNA مادر پوشانده گردد، اندازه‌گیری شود.

برای رسیدن به این هدف فرض کردم که یک راه می‌تواند شمارش متوالی ملکول‌های DNA در پلاسمای مادر باشد. با این استراتژی با افزایش تعداد مولکول‌های شمارش‌شده می‌توان به هر درجه‌ای از دقت که مایل باشیم برسیم. به کمک همکارانم در دانشگاه چینی هنگ‌کنگ یعنی Rossa Chiu و Allen Chan (شکل 2) در سال 2007 مدلل کردیم که این نیت به‌وسیله single-molecule PCR (بیشتر به نام Digital PCR شناخته می‌شود) تحقق یابد. پس از آن در سال 2008 نشان دادیم که massively parallel sequencing (که next generation sequencing هم نامیده می‌شود) مزیت قابل‌توجهی نسبت به Digital PCR در اجرای این روش شمارش دارد و سندرم داون جنین را با حساسیت و ویژگی خیلی زیاد در پلاسمای مادر تشخیص می‌دهد.

پس از آن نسبت به اعتبارسنجی این روش در مقیاس وسیع و در چند مرکز اقدام کردیم و به حساسیت تشخیصی 100% و ویژگی 98% دست یافتیم.

نتایج این مطالعه توسط گروه‌های دیگر تکرار شد. این تکنولوژی در نیمه دوم سال 2011 در خدمت تشخیص بالینی درآمد و در طی سه سال بیش از 700000 پلاسمای مادر در بیش از 50 کشور با این روش آزمایش شد. این پیشرفت یکی از سریع‌ترین موارد بکارگیری تست‌های ژنومیک است.

پس از دستیابی به تست غیرتهاجمی تشخیص سندرم داون، به دنبال این بودم که بدانم تا چه حد می‌توان این تکنولوژی را توسعه داد، لذا در سال 2010 تیم تحقیقاتی من توانست روشی را برای توالی‌یابی تمامی ژنوم جنین در پلاسمای مادر راه‌اندازی کند. این روش بر توالی‌یابی عمیق پلاسمای مادر مبتنی است که ده‌ها بار ژنوم انسانی را پوشش می‌دهد. پس از آن با رفرانس قرار دادن توالی ژنومیک پدر و مادر، ژنوم جنین استخراج می‌گردد. این روش توسط سایر محققین مورد تأئید قرار گرفت.

فراتر از ژنوم در سال 2013 تیم من نشان داد که می‌توان اپی‌ژنوم جنین را در پلاسمای مادر تشخیص داد. این روش می‌تواند یک راهکار بالقوه جهت اکتشاف ارتباط پیچیده بین تغییرات بیوشیمیایی ژنوم جنین و پیامدهای فیزیولوژیک باشد.

از آنجائی که ایده اولیه کار بر روی DNAی پلاسما از حیطه سرطان‌شناسی به ذهن من خطور کرده بود تصمیم گرفتم که به‌موازات کار بر روی جنین استفاده از DNA پلاسما را در حیطه تشخیص سرطان نیز تعقیب کنم، لذا آزمایش‌های سرطان‌شناسی را مشابه روش‌های تشخیص DNAی جنین با استفاده از RT-PCR، مارکرهای متیلاسیون DNA، مارکرهای mRNAی پلاسما و غیره ایجاد نمودم. اخیراً به خاطر موفقیت توالی‌یابی DNAی پلاسما در تشخیص ناهنجاری‌های کروموزومی، تیم من روش مشابهی را برای راه‌اندازی یک تست فراگیر شناسایی سرطان راه‌اندازی نمود. داده‌های اخیر ما در این زمینه بسیار امیدوارکننده است و نشان می‌دهد که این روش را می‌توان برای شناسایی سرطان‌های مختلف در یک نمونه خون بکار گرفت. نتایج ما با نتایج سایر گروه‌ها همخوانی دارد.

در مجموع، 17 سال اخیر برای من بسیار هیجان‌انگیز بود چرا که موفق به شناسایی DNAی جنین در خون مادر شدم و روش‌هایی جهت مطالعه آن و تشخیص مولکولی ایجاد کردم. همچنین برای من و همکارانم بسیار دلگرم‌کننده است وقتی که مشاهده می‌کنیم که این روش در سطح جهانی پذیرفته شده و تشخیص قبل از تولد را برای زنان باردار کم استرس‌تر و برای جنین آن‌ها بی‌خطرتر نموده است. همچنین فرصتی برای ما پدید آمده تا در خصوص جنبه‌های مختلف اجتماعی، حقوقی و اخلاقی این مقوله بحث نموده و بهترین راه را برای استفاده از این تکنولوژی در سیستم‌های بهداشتی بیابیم.

دکتر رضا باقری

منبع: اخبار آزمایشگاهی